原纤维蛋白-1（FBN1）的基因突变与马凡综合征（MFS，也称马方综合征）相关，这是一种常染色体显性遗传的结缔组织疾病。大多数FBN1基因突变属于错义或无义突变。针对FBN1基因的传统分子遗传学检测（如Sanger测序）可能会遗漏基因调控区域或非编码序列中的致病性突变，以及部分或全部基因的缺失与重复。研究人员对两名马凡综合征患者开展了下一代测序、多重连接依赖探针扩增技术（MLPA）和缺口PCR（gap PCR，也译作裂口PCR、跨越断点PCR）检测，以筛选致病性突变。研究人员在两名患者的FBN1基因中发现了两处大片段缺失：其中一名患者存在一个0.23 Mb的缺失（基因坐标NC_000015.9:g.48550506_48779360del），覆盖FBN1基因的5'非翻译区至第6外显子；另一名患者则存在一个1416 bp的缺失（基因坐标NC_000015.9:g.48410869_48412284del），该缺失累及FBN1基因的最后一个外显子——第66外显子。本研究结果扩充了FBN1基因大片段缺失的已知类型，同时强调了在临床基因检测中筛查FBN1基因大片段缺失的重要性，尤其针对具有经典马凡综合征表型的患者。
背 景
马凡综合征（MFS；孟德尔遗传在线数据库编号#154700）是一种常染色体显性遗传性结缔组织疾病，主要累及眼、骨骼和心血管系统，患病率约为1/5000。MFS由FBN1基因突变引起，该基因位于15号染色体q21.1区域，编码分子量为320 kDa的细胞外基质糖蛋白——原纤维蛋白-1，它是微原纤维的主要组成成分。FBN1是一个包含 66 个外显子的大型基因。MFS患者的临床表现多样，从单一症状到严重多器官受累不等，即使在携带相同FBN1基因突变的家庭成员中，也存在这种症状差异。MFS相关的心血管疾病（如动脉夹层）可能危及生命，即使在青年患者中也是如此。MFS的诊断基于修订的根特标准。某些疾病（如洛伊-迪茨综合征和血管型埃勒斯-当洛斯综合征）可能表现出与MFS相似的症状和表型。当缺乏马凡综合征特有的临床表现（如晶状体脱位）时，区分这些疾病的唯一可靠方法是基因检测。由于MFS及其相关综合征的疾病管理和治疗指南各不相同，准确诊断具有重要的临床意义。
展开剩余88%截至目前，人类基因突变数据库（HGMD）已报道了FBN1基因上分布的 3000 余种突变，其中错义突变占多数。尽管如此，遗漏大片段缺失和重复仍是临床检测中的关键疏漏。目前，下一代测序（NGS）被认为是临床疾病基因筛查的有力技术。多重连接依赖探针扩增（MLPA）是一种常用的快速便捷的大片段缺失和重复筛查技术，因其操作简便、效率高而被广泛应用。因此，越来越多的FBN1基因大片段基因重排被发现（详见表1）。
▲表1 FBN1基因大片段缺失的MFS病例总结
在本研究中，研究人员通过NGS技术在MFS患者中检测到FBN1基因的两处大片段缺失，并利用MLPA技术对这些缺失进行验证，同时通过缺口PCR或全基因组测序（WGS）确定了缺失断点。本研究结果扩充了FBN1基因大片段缺失的已知类型，同时强调了在临床基因检测中筛查FBN1基因大片段缺失的必要性，尤其针对具有经典MFS表型的患者。
研究方法
下一代测序（NGS）
使用血液DNA提取试剂盒提取基因组总DNA。采用定制化捕获芯片和测序仪分析潜在突变。本研究的目标区域包含三个基因——FBN1、TGFBR1和TGFBR2的所有外显子及其相邻内含子区域各20个碱基对。NGS分析的平均测序深度为500–1000×，所有外显子均达到足够的测序深度。
多重连接依赖性探针扩增（MLPA）
为确认FBN1基因中的大片段缺失或重复，研究人员使用市售试剂盒开展多重连接依赖探针扩增（MLPA）检测，这些试剂盒包含针对FBN1基因所有外显子的探针。按照制造商操作说明，取每位患者的 100–200 ng基因组DNA进行杂交反应，随后采用ABI 3130遗传分析仪通过毛细管电泳分离各MLPA检测的扩增产物，最终采用Coffalyser软件分析检测结果。
{jz:field.toptypename/}全基因组测序（WGS）
使用从血液中提取的基因组DNA对病例1进行全基因组测序（WGS）。测序的平均深度为 28.5×。将得到的序列文件通过Isaac Aligner软件与人类参考基因组hg38进行比对。随后，使用Nexus Copy Number软件对全基因组测序数据进行拷贝数变异（CNV）分析。
断点的识别与验证
结合全基因组测序（WGS）与多重连接依赖探针扩增（MLPA）的检测结果，研究人员通过裂口PCR（gap PCR）确定缺失断点，以此验证患者1和患者2的FBN1基因缺失情况，随后采用ABI 3130遗传分析仪进行Sanger测序验证。针对患者2的儿子，也实施了相同的检测流程。
研究结果
临床表现
患者的临床表现及家族史总结于表2中。
▲表2 患者的临床特征
患者1身高 184 cm，体重 70 千克。他表现为经典型马凡综合征（MFS），合并广泛的胸主动脉及腹主动脉夹层、关节过度活动、拇指征与腕征阳性、双侧晶状体脱位、硬脊膜扩张，腰背部及臀部可见明显的弥漫性条纹。他的臂展身高比为 1.01。23 岁时，超声心动图检查显示升主动脉窦部扩张，直径为 4.95 cm（Z值＞2.0），开云官方app下载合并重度二尖瓣脱垂伴瓣膜反流及全心增大。计算机断层扫描显示右肺大疱。依据主动脉扩张及双侧晶状体脱位的临床特征，患者1被诊断为马凡综合征。先证者的父母无马凡综合征相关表现，但未接受基因检测。
患者2身高 172 cm，体重 60 千克。她存在升主动脉夹层、关节过度活动、拇指征与腕征阳性及硬脊膜扩张。46 岁时，超声心动图检查显示升主动脉窦部扩张，直径为 4.9 cm（Z值 ＞2.0），伴主动脉瓣反流。充分散瞳后，患者接受了裂隙灯检查，未发现晶状体脱位。但她拒绝接受超声生物显微镜检查，因此无法完全排除轻度晶状体脱位的可能。先证者 20 岁的儿子身高 192 cm，体重 86 kg。他的臂展身高比为 0.98。他表现为拇指征与腕征阳性、高腭弓及弥漫性条纹。视力检查显示 400 度近视。未接受其他检查。患者的父母均已去世，母亲为猝死。此外，患者的姐姐死于主动脉夹层。
患者1和患者2接受了支架象鼻技术的全主动脉弓置换术，以治疗动脉夹层。
下一代测序（NGS）
在患者1和患者2体内分别检测到两处大片段杂合缺失，分别为外显子1-6缺失（EX1_6 DEL）和外显子66缺失（EX66 DEL）。
多重连接依赖性探针扩增（MLPA）
对患者1行多重连接依赖探针扩增（MLPA）检测，结果显示对应外显子1-6的片段相对峰面积降低（图1a），提示上述外显子存在杂合缺失。
▲图1 两名患者的半定量MLPA分析结果
对于患者2，多重连接依赖探针扩增（MLPA）检测显示：原纤维蛋白1基因（FBN1）外显子66的436核苷酸探针相对峰面积降低，提示该外显子存在杂合缺失；而FBN1外显子66的472核苷酸探针峰面积则保持正常（图1b）。
全基因组测序（WGS）
WGS检测到一个0.23 Mb的缺失突变（基因坐标：NC_000015.9:g.48550506_48779360del），该突变涵盖原纤维蛋白1基因（FBN1）的5'非翻译区至外显子6（图2）。该突变未在人类基因突变数据库（HGMD）或ClinVar数据库中被报道。根据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）的遗传变异分类指南，该缺失突变符合一项极强致病性证据（该缺失可能引发无义介导的mRNA降解）、一项中等致病性证据（该变异未在Decipher数据库和综合基因组浏览器[IGV]中被报道）以及一项支持性致病性证据（患者表型与FBN1基因缺陷导致的马凡综合征[MFS]表型相符），开云即证据组合为PVS1+PM2_Supporting+PP4。因此，该变异可被归类为致病性（P）变异。
▲图2 利用二代测序技术（NGS）检测拷贝数变异（CNV）
断点的识别与验证
通过覆盖缺失断点的缺口PCR（gap PCR）技术对患者1的缺失进行了再次验证，随后进行了Sanger测序（图3）。
▲图3 患者1断点的检测结果
同样，通过缺口PCR（gap PCR）验证了患者2的缺失突变。琼脂糖凝胶分析显示，PCR产物中除正常条带外，还存在一条更短的条带（图4）。对该短条带进一步行桑格测序，发现原纤维蛋白1基因（FBN1）外显子66存在1416bp的缺失突变（基因坐标：NC_000015.9:g.48410869_48412284del）（图5）。Sanger测序证实，患者2的儿子遗传了来自母亲的相同突变。该缺失突变在人类基因突变数据库（HGMD）和ClinVar数据库中均未见报道。依据美国医学遗传学与基因组学学院（ACMG）的遗传变异分类指南，该缺失突变符合1项极强致病性证据（PVS1）和1项中等致病性证据（PM2_Supporting，该变异未在Decipher数据库和综合基因组浏览器（IGV）中被报道），即证据组合为PVS1+PM2_Supporting。因此，该变异可被归类为可能致病性（LP）变异。
▲图4 患者2和对照样本的gap PCR结果
▲图5 患者2中断点的确认
讨 论
本研究首先采用靶向二代测序（targeted NGS）技术筛查马凡综合征（MFS）患者的突变，随后通过多重连接依赖探针扩增技术（MLPA）进行验证。通过全基因组测序（WGS）和Sanger测序确定了突变断点。结果在两名无亲缘关系的患者中发现了FBN1基因内的两个新型大片段缺失突变：一个涵盖外显子1–6，另一个位于外显子66。我们的研究结果强调了在马凡综合征患者中筛查大片段基因组突变的重要性，并进一步扩展了与马凡综合征相关的FBN1基因突变谱。
尽管多次尝试使用缺口PCR（gap PCR）技术，我们仍未能确定患者1的突变断点。不过，最终通过全基因组测序检测到了该断点。Benke等人在一项研究中报道，他们利用全基因组测序发现一名马凡综合征患者存在32kb的FBN1基因缺失突变。在本研究中，全基因组测序证实患者1携带一个0.23Mb的缺失突变，范围从FBN1上游邻近基因CEP152的内含子12延伸至FBN1的内含子6。CEP152基因包含26个外显子，编码一种152kDa的中心体蛋白，该蛋白可能在人类脑容量的进化中发挥了重要作用。由于该基因的致病性变异会导致常染色体隐性遗传病（OMIM# 614852和OMIM# 613823），而患者1除马凡综合征表型外未出现其他相关表型。此前已有研究报道了FBN1基因外显子1以外的缺失突变。值得注意的是，患者1中发现的突变与其中一项研究中描述的突变极为相似，两者均涉及CEP152和FBN1基因的缺失，只是具体突变断点不同。
在患者1中，FBN1基因外显子1–6的缺失消除了ATG起始密码子及其上游的一个推定启动子序列。因此，该缺失可能导致FBN1转录本缺陷，进而仅保留一个有功能的FBN1等位基因。这些结果表明，FBN1基因单倍剂量不足可能在该患者的马凡综合征发病机制中发挥作用。患者1表现为典型的马凡综合征表型，具有多系统畸形特征。已有少数研究报道了FBN1基因的杂合缺失突变。2011 年的一项研究发现一名患者存在外显子1至外显子5的缺失。2007年的另一项研究报道两名患者分别携带外显子1和外显子1–16的缺失突变。此外，2017年的一项研究描述一名患者存在外显子1–36的缺失。这些患者均仅保留一个有功能的FBN1等位基因，且均表现出典型的马凡综合征表型。
关于马凡综合征表型与基因型相关性的研究一直在持续进行。Gergely等人发现，缺失突变导致调控元件的缺失（如STAT3转录结合位点的缺失）可能引发更严重的临床表现，且似乎在这种单基因疾病的心血管表型发展中发挥作用。他们对已发表的拷贝数变异（CNVs）数据进行分析后发现，25名患者中有5名存在潜在的STAT3转录结合位点。其中一名患者的缺失突变影响了外显子1、外显子2以及启动子区域，与本研究中的患者1情况相似。因此，患者1中影响STAT3结合位点的缺失突变可能导致了严重的心血管症状。
患者1出现了硬脊膜扩张，这是马凡综合征中一种不太受关注的特征。硬脊膜扩张是指硬脊膜囊扩张并伴有椎体骨质侵蚀。目前尚未发现硬脊膜扩张与特定类型的FBN1基因突变存在一致的关联。患者2携带FBN1基因外显子66的1416bp缺失突变（基因坐标：NC_000015.9:g.48410869_48412284del）。经缺口PCR和桑格测序证实，该缺失突变涵盖内含子65的905bp和外显子66的 511 bp（其中编码序列 390 bp，3'非翻译区[3’UTR]121 bp）。MLPA检测结果显示，FBN1基因外显子66的436nt探针相对峰面积降低，而472nt探针的峰面积保持正常。这一结果表明外显子66存在部分缺失，导致探针无法与靶序列结合和相互作用，从而无法进行扩增，最终呈现阳性结果。MLPA的检测结果与缺口PCR的结果一致。编码区 390 bp的缺失可能导致FBN1分子缩短；3'UTR区域的缺失可能对患者表型产生影响。已有研究在马凡综合征患者中发现FBN1基因的3'UTR突变，其分子机制表明内质网应激反应参与了主动脉瘤的形成。3'UTR是mRNA分子中不编码蛋白质的区域，但在基因调控和mRNA稳定性中发挥着关键作用。该区域的突变可能影响基因表达并导致疾病表型。目前尚不清楚患者2中外显子66部分缺失形成的截短型mRNA是否会触发无义介导的mRNA降解，也需要进一步研究马凡综合征患者2是否由显性负效应导致。
超声生物显微镜是近年来发展起来的一种先进诊断技术，因其能够直接检测晶状体悬韧带断裂，被认为是诊断晶状体脱位的金标准。在一些临床病例中，即使通过裂隙灯检查（可能无法观察到虹膜震颤），也难以识别轻度晶状体半脱位。在这种情况下，可采用超声生物显微镜检查对悬韧带情况进行360°评估，从而检测出轻微和隐匿性的不完全晶状体脱位。患者2拒绝接受超声生物显微镜检查，因此无法完全排除轻微晶状体脱位的可能性。
MLPA方法通常用于检测特定基因组DNA或RNA序列中的异常拷贝数变异（CNVs）。不过，该方法也存在一定的技术局限性。首先，它主要适用于检测基因缺失或重复，并非设计用于直接检测点突变。其次，它无法用于单细胞检测。此外，如果点突变位于探针末端，可能会导致假阳性结果。因此，MLPA方法仅限于检测特定的靶基因。
本研究报道新增了FBN1基因大片段缺失突变的类型，强调了在临床基因检测中筛查FBN1基因大片段缺失的重要性，尤其针对具有典型马凡综合征表型的患者。
马凡综合征双基因大片段重排检测（MLPA方法学）针对马凡综合征症状相关基因FBN1及TGFBR2进行检测，评估是否存在拷贝数异常（如大片段缺失或重复），为临床诊断、遗传咨询提供重要分子依据。必要时需要增选遗传病全外显子组基因检测（WES，NGS方法学）等项目。小编还找来了相关指南以飨读者：罕见病诊疗指南—马方综合征-附下载
▲马凡综合征双基因大片段重排检测
参考文献：
Lu， X.， Wang， R.， Li， M. et al. Identification of two novel large deletions in FBN1 gene by next-generation sequencing and multiplex ligation-dependent probe amplification. BMC Med Genomics 17， 47 (2024). https://doi.org/10.1186/s12920-024-01822-w
发布于：江苏省
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